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Dissertation: Sadrine Tchoukouegno-Ngueu


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Dissertation: Sadrine Tchoukouegno-Ngueu

Dissertation / Doktorarbeit / Thesis

Institut für Kreislaufforschung und Sportmedizin
Abt. Molekulare und Zelluläre Sportmedizin
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Tchoukouegno-Ngueu, Sadrine (2013): BIOACTIVITY OF PLANTS SECONDARY METABOLITES~\\ Estrogenic, cytotoxic and anabolic effects on estrogen target organs of an extract of Erythrina excelsa and Ecdysterone

Zusammenfassung:
Zusammenfassung

Heilpflanzen dienen als primäre Gesundheitsversorgung in den meisten asiatischen und afrikanischen Ländern. In westlich geprägten Ländern in denen hauptsächlich auf naturwissenschaftlichen Grundsätzen basierende Medizin praktiziert wird, werden Stoffe aus pflanzlicher Herkunft entweder direkt als Kräuterformulierungen oder als Ergänzung zu bestehenden Therapien verwendet. Daneben können Pflanzen mit aktiven Wirkstoffen auch Teil der Ernährung sein. Es besteht die allgemeine Überzeugung, dass pflanzliche Heilmittel aufgrund ihres natürlichen Ursprungs sicher sind. Daher werden sie oft im Rahmen selbsttherapeutischer Maßnahmen verwendet und sind in Deutschland auch nicht rezeptpflichtig. Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Bioaktivität, Wirkungen aber auch potentiellen Nebenwirkungen derartiger pflanzlicher Heilmittel. Hierbei stehen Extrakte aus Erythrina excelsa sowie die Substanz Ecdysterone im Mittelpunkt des Interesses. Erythrina excelsa ist eine Pflanze die in der kamerunischen traditionellen Medizin zur Behandlung von Wechseljahrsbeschwerden und gynäkologische Tumoren Anwendung findet. Ob Erythrina excelsa allerdings wirklich pharmakologisch aktive Substanzen enthält, die derartige Wirkungen erzielen können, wurde bisher noch nicht untersucht. Ecdysterone (Ecdy) ist ein Inhaltsstoff von verschiedenen Pflanzen, die in der chinesischen, ayurvedischen und russischen traditionellen Medizin zur Behandlung unterschiedlichster Beschwerden verwendet werden. Für Ecdy konnte eine anabole Wirkung in vitro und in vivo gezeigt werden. Obwohl die zugrunde liegenden Mechanismen noch nicht aufgeklärt sind, wird es intensiv als Nahrungsergänzungsmittel zur Steigerung des Muskelaufbaus beworben und auch von Bodybuildern verwendet. Ein Missbrauch zum Doping in anderen Sportarten wird befürchtet. Die Ziele dieser Arbeit waren zum einen die Bioaktivität von Extrakten von Erythrina excelsa, die in Bezug zur traditionellen Anwendung in der Naturmedizin stehen, sowie die biologisch aktiven Inhaltsstoffe in den Extrakten näher zu charakterisieren. Zum anderen sollten die Mechanismen der anabolen Wirkung von Ecdysterone untersucht werden.
Mittels Yeast Estrogen Screen (YES), uterotrophen Assay und des MTT-Assay konnte gezeigt werden, dass ein Äthanolextrakt von E. excelsa östrogene/anti-östrogene und zytotoxische Effekte aufweist. Eine dreitägige subkutane Verabreichung des Extraktes in einer Dosis von 50 mg/kg KG/Tag an ovariektomierten Wistar Ratten führte zu signifikanten östrogenen Wirkungen auf morphometrische Parameter der Gebärmutter (Feuchtgewicht und epithelialen Höhen) und auf die Expression von Östrogen-abhängigen Genen in der Gebärmutter (C3 und Clusterin) und in der Leber (CaBP9K und IGFBP-1). Bei einer Dosis von 100 mg/kg KG/Tag zeigte der Extrakt unerwartet auf die beschriebenen biologischen Endpunkte eine anti-östrogene Wirkung. Eine fünftägige Behandlung von Estrogenrezeptor (ER) -positiven MCF-7 Brustkrebszellen mit dem Extrakt führte zu einem biphasischen Profil: Bei niedrigen Konzentrationen kam es zu einem leichten Anstieg der Zellviabilität, bei höheren Konzentrationen dagegen zu einer Induktion von Zelltod. Dagegen wurde bei der Behandlung von ER negativen HT-29 Zellen Zytotoxizität bei allen getesteten Konzentrationen beobachtet. Um die Wirkstoffe des Extraktes näher zu charakterisieren, wurde eine Vakuum Flüssigchromatographie Fraktionierung durchgeführt. Biologisch aktive Fraktionen wurden mittels des YES Assays identifiziert und die biologische Wirkung dieser Fraktion auf Proliferation und Apotose von MCF-7-Brustkrebs-Zellen mittels Durchflusszytometrie, Genexpressionsanalyse und Immunhistochemie untersucht. Die Dichloromethan-Methanol (50:50 v/v) Fraktion (F4), die in Bezug auf östrogene und zytotoxische Wirkung die aktivste Fraktion war, zeigte eine nicht-monotone Konzentrations-Wirkungs-Kurve auf den Zellzyklus, die Proliferation und Apoptose von MCF-7 Brustkrebszellen. Bei niedrigen Konzentrationen und in Abwesenheit von E2, förderte F4 Östrogenrezenptor- abhängig die Proliferation von MCF-7 Zellen (Hochregulation von Cyclin D1 und Herunterregulation des Bax/Bcl-2-mRNA Verhältnisses). Interessanterweise wirkte F4 in den gleichen Konzentrationen bei Anwesenheit von E2, als Antagonist und verhinderte ein E2-induziertes Zellwachstum. Bei höheren Konzentrationen modulierte F4 den Zellzyklus zugunsten einer gesteigerten Apoptose (Erhöhung des Caspase-gespaltenen Zytokeratin 18, Hochregulation des Bax/Bcl-2 Verhältnisses und Herunterregulation von Cyclin-D1-mRNA). In Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Dr. Halabalaki von der Abteilung für Pharmakognosie und Naturstoffchemie der Universität von Athen wurde eine weitere Charakterisierung des Extraktes mittels LC-HRMS und LC-HRMS/MS Analyse durchgeführt um die im Extrakt enthaltenen Isoflavonoide zu identifizieren. Diese Analyse zeigte, dass Pyran- und Prenyl-Isoflavonoidderivate die charakteristischen chemischen Stoffe des Extrakts sind was auch die beobachtete Kombination der biologischen Eigenschaften des Extraktes erklären könnte.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden die anabolen Wirkmechanismen von Ecdysterone, Erythrina excelsa Extrakt und Genistein in differenzierten C2C12 Myoblasten, einem Zellkulturmodell für Skelettmuskelhypertrophie untersucht. Als untersuchter biologischer Endpunkt diente die Zunahme des Durchmessers von C2C12 Myotuben. Für die nähere Charakterisierung der involvierten molekularen Mechanismen wurden Studien mit Vergleichssubstanzen wie Androgenrezeptoragonisten (DHT), Androgenrezeptorantagonisten (Flutamid), anabol wirkende Peptidhormone (IGF-1) und verschiedene Östrogenrezeptor bindende Substanzen mit agonistischen (E2), antagonistischen sowie ER alpha und ER beta selektiven Bindungseigenschaften verwendet. Mit diesem Modell konnten die wachstumsfördernden Wirkungen von IGF1, DHT, E2, Ecdy und des Phytoestrogens Genistein auf die Skelettmuskulatur bestätigt werden. Co-Behandlung von Myotuben mit Ecdy und ZK führte zu einer Hemmung der Ecdy-induzierten Hypertrophie. Darüber hinaus führte auch eine Co-Behandlung von Myotuben mit E2 oder Ecdy und dem selektiven ER beta Antagonisten zu einer Antagonisierung der hypertrophen Wirkung von beiden Substanzen, was ein Zeichen von ERβ-abhängigem Effekt ist.
Zusammenfassend zeigen die Befunde dieser Arbeit einerseits, dass der Extrakt von Erythrina excelsa biologische Effekte aufweist, die in engem Zusammenhang zu seiner traditionellen Verwendung stehen. Sie weisen auch darauf hin, dass diese Pflanze eine Quelle pharmakologisch aktiver Stoffe ist, die von potentiellem Interesse für weitere Untersuchungen sind. Darüber hinaus zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass Stoffe mit ER beta Bindungseigenschaften das Skelettmuskelwachstum fördern. Diese Erkenntnis ist von Interesse für die Behandlung von atropischen Erkrankungen des Skelettmuskels wie z. B der altersbedingten Abnahme der Muskelmasse (Sarkopenie). Allerdings kann dieser Effekt auch zum Zwecke des Dopings missbraucht werden. Daher sind diese Befunde auch für die Ausgestaltung von Anti-Doping-Bestimmungen von Bedeutung.



Summary

Medicinal plants serve as primary health care in most Asian and African countries. In developed countries where allopathic medicine is the most practiced form of medicine, chemicals of plant origin are increasingly consumed either as herbal formulations, diet, or complement to existing therapies in order to prevent or treat diseases. There is a general belief that because of their natural origin, herbal remedies are safe. Therefore they are commonly used in self therapeutic measures and are not prescribed in Germany. This work deals with the bioactivity and potential side effects of such herbal remedies. Namely the extract from Erythrina excelsa and the pure compound Ecdysterone were the focus of our attention. Erythrina excelsa is a plant used in the Cameroonian traditional medicine to alleviate menopausal symptoms and to treat female gynecological tumors. However, no test for biological activities evidencing these health benefit claims has been made so far. Ecdysterone (Ecdy) is the principal constituent of several plants used in the Chinese, Ayurvedic, and Russian traditional medicines to treat various ailments. Ecdy has been shown to exert anabolic properties in vitro and in vivo. Although the mechanisms underlying these effects are not yet elucidated, it is advertised as a food supplement to increase muscle mass and physical performance and is used by bodybuilders. A misuse for doping purpose in sports is suspected. The aims of this thesis were on the one hand to investigate the biological activities likely to explain the traditional use of Erythrina excelsa and to characterize its biologically active ingredients. On the other hand, this work also aims at examining the mechanisms underlying the anabolic effect of ecdysterone
Using the yeast estrogen screen, the uterotrophic assay, and the MTT assay, we showed that an ethanol extract of E. excelsa exhibits estrogenic/anti-estrogenic and cytotoxic effects. A three-day subcutaneous administration of the extract at a dose of 50 mg/kg BW/day to ovariectomized Wistar rats produced significant estrogenic effects on uterine morphometric parameters (wet weight and epithelial height) and on the gene expression of estrogen responsive genes in the uterus (C3 and Clusterin) and in the liver (CaBP9K and IGFBP-1). Unexpectedly, at a dose of 100 mg/kg BW/day the extract significantly decreased the same parameters below the control level indicating anti-estrogenic effects. The extract exhibited a biphasic profile on the growth of ER positive MCF-7 cells with a slight increase of cell viability at low concentrations and induction of cell death at higher concentrations. But on ER negative HT-29, cytotoxicity was observed at all concentrations tested. To get more insights into the active principles of the extract, a bioactivity-guided fractionation was performed and the bioactive fractions were identified by means of both YES and XTT assays. The effect of the most active fraction [Dichloromethane-Methanol (50:50, v/v) (F4)] on the proliferation and apoptosis of MCF-7 breast cancer cell line was assessed by flow cytometry, gene expression analysis and immunohistochemistry. F4 exhibited a non-monotonic concentration-response effect on the proliferation and apoptosis of MCF-7 breast cells. At low concentrations and in the absence of E2, F4 promoted cell cycle progression through ER signaling and modulated gene expression in favor of cell survival (upregulation of cyclin D1 and and downregulation of the Bax/Bcl-2 ratio mRNA). Interestingly, when E2 was present, F4 at the same concentrations acted as an antagonist and prevented E2-induced cell growth. At higher concentrations, F4 modulated the cell cycle in favor of increased apoptotic cell death (increase of caspase cleaved cytokeratin 18, upregulation of Bax/Bcl-2 ratio and downregulation of cyclin D1 mRNA). In collaboration with the group of Dr. Halabalaki from the Department of Pharmacognosy and Natural Products Chemistry of the Unviversity of Athens, a LC-HRMS and LC-HRMS/MS analysis was performed to identify the isoflavonoids contained in the extract. This analysis showed that pyran and prenyl derivatives of isoflavonoids are the most characteristic chemical groups of the extract and may explain the observed biological activities.
In the second part of this work, the mechanisms of the anabolic effect of ecdysterone, Erythrina excelsa extract and other plant secondary metabolites such as genistein were studied in a cell culture model of differentiated C2C12 myoblasts. This test system is a well established model to study the ability of anabolic substances to induce skeletal muscle hypertrophy as measured by the increase in the diameter of myotubes. Several comparative substances such as androgen receptor agonist (DHT) and antagonist (flutamide), anabolic peptide hormone (IGF-1), and different estrogen receptor binding compounds with agonistic (E2), antagonistic (ZK), and ERα and ERβ selective binding properties were used for the characterization of the involved molecular mechanisms. With this model, we confirmed the skeletal muscle growth-promoting effects of IGF1, DHT, E2, Ecdy, and the phytoestrogen genistein. Co-treatment of myotubes with ZK and Ecdy led to an inhibition of Ecdy-induced hypertrophy. In addition, a co-treatment of myotubes with E2 or Ecdy and the selective ERβ antagonist prevented both substances to induce myotube hypertrophy, what unequivocally shows an ERβ-mediated effect.
In general, the results of this work show that the extract of Erythrina excelsa has biological activities that are in close agreement with its reported traditional use to manage menopausal complaints and to treat female gynecological tumors. They also highlight the fact that this plant is a source of substances of potential interest for further pharmacological investigations. In addition, our findings also show that substances with ERβ binding affinity promote skeletal muscle growth and may provide new insights into therapeutic strategies for the treatment of skeletal muscle atrophic conditions such as the age-related decline in muscle mass (sarcopenia). However, this effect may be misused for doping purpose and is therefore also of importance for Anti-doping regulation.


24.06.2017 - 03:16