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Dissertation: Ines Moeller


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Dissertation: Ines Moeller

Dissertation / Doktorarbeit / Thesis

Deutsche Sporthochschule Köln
Institut für Biochemie
Moeller, Ines (2012): Entwicklung von Massenspektrometrie-basierten Nachweisverfahren für das Erythropoietin-mimetische Peptid Peginesatide im Rahmen der präventiven Dopingforschung Zusammenfassung:
Zusammenfassung

Für Peginesatide, den ersten Vertreter einer neuen Generation Erythropoiese-stimulierender Agenzien, wird ein hohes Missbrauchspotenzial im Leistungssport angenommen. Daher war die Entwicklung von spezifischen und empfindlichen Massenspektrometrie-basierten Nachweisverfahren in verschiedenen, für die Dopinganalytik relevanten Matrices Ziel dieser Arbeit.
Dafür wurde zunächst die Struktur des Wirkstoffes identifiziert, bevor dieser synthetisiert und mittels massenspektrometrischer sowie gelelektrophoretischer Verfahren charakterisiert wurde. Da sich die intakte massenspektrometrische Analyse nicht als eindeutiges Nachweisverfahren für die Dopinganalytik eignet, wurde das pegylierte Peptid mithilfe der Serin-Protease Subtilisin in ein proteotypisches Pentapeptid gespalten. Dieses lässt sich empfindlich mit einer Kopplung aus Flüssigkeitschromatographie und Tandem-Massenspektrometrie detektieren, erfüllt die geforderte Sequenzabdeckung und enthält zudem zur weiteren Absicherung des xenobiotischen Ursprungs eine nicht-endogene Aminosäure.
Aufbauend auf diesen Ergebnissen wurden Nachweisverfahren für Peginesatide in humanem Blut (Serum, Plasma und Blutstropfen), Urin sowie Pferdeserum entwickelt und gemäß internationalen Richtlinien validiert. Die Anwendbarkeit der Methoden wurde schließlich mit authentischen Proben aus einer in vivo Studie an Ratten unter Beweis gestellt, bei der eine therapeutische Dosis von Peginesatide verabreicht wurde und über einen Zeitraum von bis zu vier Tagen Blutstropfen, Urin und Plasmaproben gesammelt wurden. In allen drei Matrices war das charakteristische Pentapeptid nach proteolytischem Verdau bis zum Zeitpunkt der letzten Probennahme, das heißt nach 72 h im Fall der Blutstropfen, beziehungsweise 96 h für Urin und Plasma, eindeutig nachweisbar.
Damit stehen im Sinne einer präventiven Dopingforschung bereits zur Erstzulassung des Wirkstoffes in den USA (März 2012) spezifische, empfindliche und valide Nachweismethoden für den Einsatz in der Routinedopinganalytik zur Verfügung, die leicht auch in weiteren Dopingkontrolllaboratorien implementiert werden können und den Nachweis einer (missbräuchlichen) Anwendung von Peginesatide in verschiedenen biologischen Matrices für mindestens einige Tage erlauben.

Abstract

For peginesatide, the first representative of a new generation of erythropoiesis-stimulating agents, a high misuse potential in elite sports is expected. Thus, the aim of the present thesis was the development of specific and sensitive mass spectrometry-based detection methods in various biological matrices relevant to doping analysis.
In the context of this background, the molecular structure of the active ingredient was identified before it was synthesised and characterised by means of mass spectrometric as well as gel electrophoretic techniques. As a mass spectrometric analysis of the intact analyte is not applicable for a specific detection approach in sports drug testing, the pegylated peptide was subjected to proteolytic digestion by the serine protease subtilisin. The thereby generated pentapeptide fragment allows for a sensitive detection by means of liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry and fulfils the required sequence coverage. Furthermore, its xenobiotic origin is supported by a non-natural amino acid present in the fragment.
Based on these results, detection assays for peginesatide in human blood (serum, plasma or dried blood spots) and urine as well as in horse serum were developed and validated in accordance with international guidelines. Proof-of-concept for the applicability of the methods was demonstrated by analysing dried blood spots, urine, and plasma samples from an in vivo study in rats, collected after a single therapeutic dose of peginesatide over a period of up to four days. In all three matrices, the characteristic pentapeptide fragment, obtained after proteolytic digestion, was unambiguously detected until the endpoint of the study, 72 h for dried blood spots and 96 h for urine and plasma specimens, respectively.
Thus, within the scope of preventive doping research, specific, sensitive, and valid detection methods are applicable to routine sports drug testing since the time of drug approval (March 2012). Moreover, they are readily transferable to other doping control laboratories and allow for the detection of an illicit application of peginesatide in different biological matrices relevant to doping analysis for at least several days.



25.06.2017 - 03:28